12個做標(biāo)準(zhǔn)曲線過程中的常見問題

GB/T22554-2010《基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性校準(zhǔn)》中：

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍應(yīng)覆蓋正常操作條件下的被測量范圍；

2、標(biāo)準(zhǔn)樣品的組分盡量與被測樣品組分一致；

3、標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度值應(yīng)等距離的分布在被測量范圍；

4、標(biāo)準(zhǔn)樣品數(shù)量至少應(yīng)有3個濃度；

5、每個標(biāo)準(zhǔn)點至少重復(fù)2次，這個重復(fù)是指從稀釋開始。

如果國家標(biāo)準(zhǔn)有相應(yīng)的濃度系列推薦，盡量按國家標(biāo)準(zhǔn)。工作中我們經(jīng)常采用線性校準(zhǔn)，因為線性方程最為簡潔。

校準(zhǔn)曲線包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線，前者用標(biāo)準(zhǔn)溶液系列直接測量，沒有經(jīng)過預(yù)處理過程，這對于樣品往往造成較大誤差；而后者所使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過了與樣品相同的消解、凈化、測量等全過程。

標(biāo)準(zhǔn)曲線需要幾個數(shù)據(jù)點，是由所檢測組分的濃度范圍、分析儀響應(yīng)特性、干擾因素、濃度與檢測信號響應(yīng)類型有關(guān)的。

3個點：對于一些低濃度，特別是微量分析，且濃度范圍不是很大的，檢測器響應(yīng)可靠，背景干擾非常小的，則可以選用較少的工作點就行，一般有3個濃度點就足夠了，有些甚至可以只用一個濃度點就行，另一個點直接用坐標(biāo)原點。
4~6個點：對于平時測量的樣品濃度范圍較寬，并且檢測器響應(yīng)不完全是一次曲線（直線）的，可采用二次曲線或分段校正方式，以減少數(shù)據(jù)偏差，這種情況就需要多用幾個數(shù)據(jù)點，如果不分段，數(shù)據(jù)點有4~6 個就夠用。
至少兩個點：但如果是分段校正，則每段需要至少兩個數(shù)據(jù)點。而對于一些樣品無濃度范圍規(guī)律的，特別是一些檢測機構(gòu)，如果分析儀的檢測響應(yīng)可靠，環(huán)境因素影響少的，可以做校正曲線。若是環(huán)境因素影響大的，則不必做校正曲線，而采用標(biāo)準(zhǔn)加入法或標(biāo)準(zhǔn)加入-一次稀釋法反而簡便一些。

實際上，我們一般是做五個點（不包括零濃度）；一般以檢出限的5~10倍為第一個點，以后根據(jù)1倍遞增，最高濃度是最低濃度的10~20倍為宜（理化分析實驗為例）。當(dāng)然，要根據(jù)儀器的靈敏度來調(diào)整。

實驗室應(yīng)按檢測標(biāo)準(zhǔn)（方法）的要求使用標(biāo)準(zhǔn)溶液或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。所用標(biāo)準(zhǔn)溶液或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)覆蓋被測樣品的濃度范圍。檢測標(biāo)準(zhǔn)（方法）如無具體的要求，至少使用5個標(biāo)樣（除空白外）建立線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個點重復(fù)測定1-3次，對于篩選方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.98，對于確證方法，相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99。

其實，大于0.99是判斷是否為線性相關(guān)的一個標(biāo)準(zhǔn)，實際應(yīng)用中線性大于0.999才是比較理想的。線性在0.99到0.999之間的監(jiān)測結(jié)果只用接近最高濃度一半（中間濃度）的位置才比較準(zhǔn)確，如果線性大于0.999的話，在整個線性范圍內(nèi)都會有一個比較滿意的結(jié)果。

如果檢測的線性不好，可以減少標(biāo)準(zhǔn)的覆蓋范圍，將標(biāo)準(zhǔn)的濃度調(diào)整到待測樣品濃度附近，這樣結(jié)果也是非常準(zhǔn)確的。例如，樣品的濃度約20ppb，但在0~50ppb范圍建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，但線性非常不理想，這時可以將標(biāo)準(zhǔn)范圍調(diào)整到15~25ppb之間，作五個標(biāo)準(zhǔn)。

（1）線性檢驗:

即檢驗校準(zhǔn)曲線的精密度。對于以4-6個濃度單位所獲得的測量信號值繪制的校準(zhǔn)曲線，分光光度法一般要求其相關(guān)系數(shù) | r | ≥0.9990，否則應(yīng)找出原因并加以糾正，重新繪制合格的校準(zhǔn)曲線。

（2）截距檢驗：

即檢驗校準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度，在線性檢驗合格的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程 y= a+bx ，然后將所得截距a與0作t檢驗，當(dāng)取95%置信水平，經(jīng)檢驗無顯著性差異時，a可做0處理，方程簡化為y= bx，移項得x=y/b。在線性范圍內(nèi)，可代替查閱校準(zhǔn)曲線，直接將樣品測量信號值經(jīng)空白校正后，計算出試樣濃度。

當(dāng)a與0有顯著性差異時，表示校準(zhǔn)曲線的回歸方程計算結(jié)果準(zhǔn)確度不高，應(yīng)找出原因予以校正后，重新繪制校準(zhǔn)曲線并經(jīng)線性檢驗合格。在計算回歸方程，經(jīng)截距檢驗合格后投入使用。

回歸方程如不經(jīng)上述檢驗和處理，就直接投入使用，必將給測定結(jié)果引入差值相當(dāng)于解決a的系統(tǒng)誤差。

（3）斜率檢驗:

即檢驗分析方法的靈敏度，方法靈敏度是隨實驗條件的變化而改變的。在完全相同的分析條件下，僅由于操作中的隨機誤差導(dǎo)致的斜率變化不應(yīng)超出一定的允許范圍，此范圍因分析方法的精度不同而異。例如，一般而言，分子吸收分光光度法要求其相對差值小于5%，而原子吸收分光光度法則要求其相對差值小于10%等。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線屬于實驗室質(zhì)量控制的范圍，按照《實驗室資質(zhì)認(rèn)定評審準(zhǔn)則》中結(jié)果控制的要求：定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（參考物質(zhì)）進(jìn)行監(jiān)控和/或使用次級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（參考物質(zhì)）開展內(nèi)部質(zhì)量控制。

（2）準(zhǔn)則中并未對“定期”進(jìn)行規(guī)定，所以如果“定期”，就根據(jù)實驗室的實際情況來定了。

（3）既然準(zhǔn)則上沒說明，那根據(jù)一般的分析教材，當(dāng)實驗條件（包括藥劑、人員、儀器等）發(fā)生變化時，最好重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。一般來說儀器如果長期使用，并經(jīng)過檢定，是處于穩(wěn)定狀態(tài)，而人員藥劑的變化往往會較大。如果說每次換個人操作都要換曲線，那工作量就太大了。

從檢測的要求來說，因為：

1、每天所配的流動相都會有所不同，導(dǎo)致出峰的時間都會有一定的差異，峰面積相應(yīng)都有所差異。
2、檢測器光能也在不斷的衰弱，因此其每天的相應(yīng)值也有所不同，其峰面積也有差異。
基于以上原因，原則上應(yīng)該是每天都要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線校正的。
標(biāo)準(zhǔn)曲線不要每次都做，但是每次必須進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)品樣品；因為每次你的流動相和原來的不可能完全一樣，同時儀器的狀態(tài)也在變化，所以不同批次間的保留時間是不一致的，所以你必須用隨行標(biāo)準(zhǔn)品來定位與定量。

每批樣品應(yīng)測定一個校準(zhǔn)曲線中間點濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，其測定濃度與校準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)點的濃度相對誤差不得超過規(guī)定范圍，如果超過規(guī)定相對誤差，需重新繪制校準(zhǔn)曲線。

也可以這樣說，不同的分析項目,不同的分析方法,校準(zhǔn)曲線斜率的穩(wěn)定性不同。如校準(zhǔn)曲線的斜率較為穩(wěn)定,則在樣品分析時,可只測定兩個標(biāo)準(zhǔn)點,當(dāng)此兩個標(biāo)準(zhǔn)點與原曲線相應(yīng)點的相對偏差均小于5%時,可使用原校準(zhǔn)曲線。因此,樣品分析前,需根據(jù)斜率的穩(wěn)定性來確定是否需同時制作校準(zhǔn)曲線。

一般的做法，根據(jù)檢測的頻率來做，如果該項目天天都要檢測，并且檢測量較多時，要求至少每周做一次曲線。如果檢測量上，一個月數(shù)量極少的話，就一個月做一次曲線。當(dāng)然，儀器如果出現(xiàn)故障并大修后回來的，經(jīng)過檢定后，需要重新做曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線不一定非要過原點，只要線性好就可以了。因為做空白的話基本上不會過原點。過原點是強制過的，實際曲線可能不過，就會造成誤差。不過原點是因為有系統(tǒng)誤差。

針對是否過原點(0,0)問題，我想可以從原點(0,0)代表的意義來考慮：即所測組分濃度為零的時候，信號響應(yīng)值（液相色譜也就是峰高或者峰面積）是否也為零。通常來說色譜分析是屬于這種情況的，因而可以把（0,0）點作為一個濃度水平計入標(biāo)準(zhǔn)曲線（甚至不需要真的去配一個濃度為零的標(biāo)準(zhǔn)溶液來進(jìn)樣），這也是單點法定量的一個依據(jù)；而類似的情況在光譜法測定時就講不通了，濃度為零的標(biāo)準(zhǔn)溶液（本底）響應(yīng)信號（吸光度）往往不是零，這個時候標(biāo)準(zhǔn)曲線就不一定過原點了。

線性范圍這個大家都比較清楚，主要從相關(guān)系數(shù)r看，一般要求r大于等于三個九。之前做實驗有時候濃度高時，線性不好，高濃度點不在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，而是在標(biāo)準(zhǔn)曲線的下面，而且離擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較遠(yuǎn)。遇到這種情況，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)就很差，有時候才一個九，最后我終于想明白了，如果自己用手動擬合的話，用平滑的曲線去連接所有點的話，你就會發(fā)現(xiàn)，如果在線性范圍內(nèi)，連接起來就是直線，如果超出了線性范圍，連接起來就是一條彎曲的曲線。

GB5750.3-2006 8.2.7項有如下規(guī)定：校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)只舍不入，保留到小數(shù)點后出現(xiàn)非9的一位，如0.99989→0.9998。如果小數(shù)點后都是9時，最多保留小數(shù)點后4位。

標(biāo)準(zhǔn)曲線我們通常采用的是Y=a+bX，曲線擬合完必須要做統(tǒng)計檢驗，且要做統(tǒng)計完備的線性檢驗和失擬檢驗，然后再做a與0的差別檢驗，如果a與0的統(tǒng)計學(xué)上無差異，你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線，擬合出來后同樣做線性檢驗和失擬檢驗，如果線性檢驗合格（P<0.05）且失擬檢驗合格（p>0.05）此時你就可以采用Y=bX。

二次曲線的采用同樣是這樣的道理，如果你Y=a+bX時擬合不合格，你就考慮用Y=a+bX+cX2，同樣做失擬檢驗，考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗和失擬檢驗合格，則采用Y=a+bX形式，這樣符合統(tǒng)計學(xué)上參數(shù)最少的統(tǒng)計簡潔性原則。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法有一定的優(yōu)勢，也有一定的缺陷，它特別適合于大量樣品的分析。但由于每次樣品分析的色譜條件（檢測器的響應(yīng)性能，柱溫，流動相流速及組成，進(jìn)樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。此外，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制時，一般使用欲測組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品（或已知準(zhǔn)確含量的樣品），而實際樣品的組成卻千差萬別，因此必將給測量帶來一定的誤差。

了解各個分析項目校準(zhǔn)曲線斜率的穩(wěn)定性及影響穩(wěn)定性的主要因素,可決定是否能采用帶標(biāo)點檢驗原校準(zhǔn)曲線,省略重新制作校準(zhǔn)曲線;從校準(zhǔn)曲線斜率的變化,可判斷標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性,從而確定其標(biāo)定周期;分析低濃度樣品時,應(yīng)使用高純度的水和試劑,以減少空白值,降低樣品的分析誤差。

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